CÁC KỸ THUẬT KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT: NGUYÊN LÝ, CÁCH LÀM VÀ CÁCH CHỌN ĐÚNG
 

1. Ba câu hỏi quyết định kỹ thuật

Mọi kỹ thuật kiểm nghiệm vi sinh đều trả lời một trong ba câu hỏi: bao nhiêu (định lượng), có hay không (định tính) hoặc là loài gì (khẳng định, định danh). Xác định đúng câu hỏi là chọn được nhóm kỹ thuật. Sau đó, nền mẫu, mật độ dự kiến, thời gian cần có kết quả và yêu cầu pháp lý quyết định kỹ thuật cụ thể.

Hình 1. Ba câu hỏi quyết định nhóm kỹ thuật kiểm nghiệm vi sinh

Tra cứu nhanh

Bạn cần biết	Kỹ thuật phù hợp	Mục
Bao nhiêu vi sinh vật trong 1 g thực phẩm (mật độ trung bình – cao)	Đổ đĩa; cấy bề mặt khi cần đọc hình thái, quầng	3
Bao nhiêu vi sinh vật trong 100–250 mL nước sạch, nước đóng chai	Màng lọc	3
Mật độ rất thấp, mẫu đục nhiều cặn	MPN nhiều ống	4
Coliform, E. coli trong nước – nhiều mẫu, ít nhân lực	MPN cơ chất xác định	4
Có hay không Salmonella, Listeria… trong 25 g	Tăng sinh – phân lập – khẳng định	5
Đọc kết quả theo màu, giảm bước khẳng định	Môi trường sinh màu	6
Kiểm tra nội bộ tại nhà máy, không pha môi trường	Film khô	6
Khuẩn lạc nghi ngờ có đúng loài mục tiêu không, là loài gì	Gram, sinh hoá, MALDI-TOF, huyết thanh	7
Cần kết quả âm tính sớm để xuất hàng	Miễn dịch hoặc PCR sau tăng sinh	8
Bề mặt đã sạch chưa, ngay tại dây chuyền	ATP phát quang	8
Sản phẩm không vô trùng có đạt giới hạn vi sinh không	Thử giới hạn vi sinh vật	9
Thuốc tiêm, thuốc nhỏ mắt có vô trùng không	Thử vô trùng	9
Phòng sạch cấp A–D có đạt giới hạn không	Giám sát vi sinh môi trường	9

 

2. Bước nền: chuẩn bị mẫu, pha loãng và tính kết quả

Vi sinh vật phân bố không đều trong mẫu, nên mọi kết quả định lượng phụ thuộc vào bước đầu tiên: tạo huyền phù đồng nhất và pha loãng đến mật độ đếm được.

Hình 2. Chuẩn bị huyền phù ban đầu 10⁻¹ và dãy pha loãng thập phân

• Cân 10 g hoặc 25 g mẫu, thêm 9 phần dịch pha loãng (90 mL hoặc 225 mL nước pepton đệm BPW hoặc nước pepton muối), đồng nhất bằng máy dập mẫu 1–2 phút để có huyền phù 10⁻¹.

• Hút 1 mL sang ống 9 mL dịch pha loãng để có 10⁻²; lắc đều vài giây, đổi đầu tip mới, lặp lại đến độ pha loãng cần thiết.

• Cấy đúng thời hạn: từ khi có huyền phù ban đầu đến khi cấy không quá 45 phút; ISO 7218:2024 khuyến nghị khoảng 20 phút.

Tiêu chuẩn: ISO 6887-1 đến -6 (chuẩn bị mẫu theo từng nhóm nền mẫu), ISO 7218 (yêu cầu chung cho kiểm nghiệm vi sinh chuỗi thực phẩm).

Lỗi hay gặp: dùng chung đầu tip giữa các bậc (kết quả cao giả); để huyền phù quá lâu (vi sinh nhân lên hoặc chết); thể tích dịch pha loãng hao hụt sau khi hấp (sai hệ số pha loãng); mẫu có chất kháng khuẩn như gia vị, mỹ phẩm, dược phẩm mà không dùng chất trung hoà hoặc không pha loãng thêm.

Công thức tính kết quả đếm khuẩn lạc

Theo ISO 7218, kết quả là trung bình có trọng số của các đĩa ở hai độ pha loãng liên tiếp. Chỉ giữ lại các đĩa có không quá 300 khuẩn lạc (hoặc giới hạn trên do phương pháp quy định), trong đó ít nhất một đĩa có từ 10 khuẩn lạc trở lên.

N = ΣC / [V × (n₁ + 0,1 × n₂) × d]

Trong đó ΣC là tổng số khuẩn lạc trên các đĩa được giữ lại; V là thể tích cấy mỗi đĩa (mL); n₁, n₂ là số đĩa ở độ pha loãng thứ nhất và thứ hai; d là độ pha loãng của dãy thứ nhất, tức độ pha loãng thấp hơn (trong ví dụ dưới đây là 10⁻²).

 

Ví dụ thực tế Mẫu thịt, đổ đĩa PCA ủ 30 °C trong 72 giờ, 2 đĩa mỗi độ pha loãng: độ pha loãng 10⁻² đếm được 168 và 215 khuẩn lạc; 10⁻³ đếm được 14 và 25 khuẩn lạc. N = (168 + 215 + 14 + 25) / [1 × (2 + 0,1 × 2) × 10⁻²] = 422 / 0,022 ≈ 19.182 → báo cáo 1,9 × 10⁴ CFU/g. Quy tắc chọn đĩa, làm tròn và trường hợp đặc biệt (đĩa quá ít, quá dày, khuẩn lạc lan) áp dụng đầy đủ theo ISO 7218 và tiêu chuẩn phương pháp.

 

3. Định lượng bằng đếm khuẩn lạc

Ba kỹ thuật cấy đĩa khác nhau ở thể tích cấy và vị trí khuẩn lạc. Thể tích cấy quyết định giới hạn đếm; vị trí khuẩn lạc quyết định có đọc được hình thái, quầng phản ứng hay không.

Hình 3. Đổ đĩa, cấy bề mặt và cấy xoắn ốc: thể tích cấy và vị trí khuẩn lạc khác nhau

3.1. Đổ đĩa (pour plate)

Nguyên lý: 1 mL dịch mẫu được trộn với 12–15 mL thạch đã giữ ở 44–47 °C. Khi thạch đông, mỗi tế bào hoặc cụm tế bào sống mọc thành một khuẩn lạc (CFU) trong hoặc trên mặt thạch. Dùng khi: vi sinh mục tiêu chịu được thạch 44–47 °C và mật độ dự kiến từ khoảng 10 CFU/g trở lên, ví dụ tổng vi sinh vật hiếu khí, coliform, E. coli, Enterobacteriaceae.

• Hút 1 mL từ mỗi độ pha loãng vào đĩa Petri vô trùng.

• Đổ thạch (PCA, VRBL, TBX…), xoay nhẹ theo hình số 8 để trộn đều, để đông; với coliform, Enterobacteriaceae phủ thêm một lớp thạch mỏng.

• Lật đĩa, ủ theo phương pháp (ví dụ PCA ở 30 °C trong 72 giờ), đếm và tính theo ISO 7218.

Tiêu chuẩn: ISO 4833-1 (vi sinh vật ở 30 °C), ISO 4832 (coliform), ISO 16649-2 (E. coli), ISO 21528-2 (Enterobacteriaceae), ISO 6222 (vi sinh vật nuôi cấy được trong nước), USP <61> (dược phẩm).

Lỗi hay gặp: thạch quá nóng làm chết vi sinh (kết quả thấp giả); khuẩn lạc nằm trong thạch nhỏ, khó nhận dạng và khó lấy để khẳng định; vi khuẩn mọc lan (Proteus, Bacillus) phủ kín đĩa.

3.2. Cấy bề mặt và cấy xoắn ốc

Nguyên lý: 0,1 mL dịch mẫu được dàn đều trên mặt thạch đã đổ sẵn và làm khô. Vi sinh không bị sốc nhiệt, khuẩn lạc thể hiện đủ hình thái, màu và quầng phản ứng. Dùng khi: cần đọc hình thái, quầng (S. aureus trên Baird-Parker, B. cereus trên MYP), vi sinh hiếu khí bắt buộc hoặc nhạy nhiệt, nấm men – nấm mốc.

• Nhỏ 0,1 mL vào giữa đĩa; khi cần giới hạn phát hiện thấp hơn, chia 1 mL trên 3 đĩa.

• Dàn bằng que trang vô trùng đến khi dịch thấm hết, để yên rồi lật đĩa ủ.

• Đếm khuẩn lạc điển hình, chọn khuẩn lạc để khẳng định (ví dụ 5 khuẩn lạc) và quy đổi theo tỷ lệ khẳng định.

Cấy xoắn ốc: máy nhả mẫu với thể tích giảm dần theo đường xoắn trên đĩa đang quay. Theo FDA BAM, một đĩa bao phủ khoảng 500–500.000 vi sinh vật/mL, nhờ đó bớt được dãy pha loãng. ISO 7218:2024 coi cấy xoắn ốc là một kỹ thuật cấy như cấy bề mặt; phòng thí nghiệm phải kiểm tra xác nhận trước khi áp dụng.

Tiêu chuẩn: ISO 4833-2, ISO 6888-1 (S. aureus), ISO 7932 (B. cereus), ISO 21527-1/-2 (nấm men, nấm mốc), ISO 11290-2 (Listeria); cấy xoắn ốc: AOAC 977.27.

Lỗi hay gặp: cấy 0,1 mL nên giới hạn đếm cao gấp 10 lần đổ đĩa (khoảng 100 CFU/g với dịch 10⁻¹); mặt thạch còn ướt làm khuẩn lạc lan, dính nhau; que trang còn nóng hoặc còn cồn làm chết vi sinh.

 

Ví dụ thực tế Bánh kem, đếm S. aureus trên Baird-Parker, cấy 0,1 mL dịch 10⁻¹: 42 khuẩn lạc đen bóng có quầng trong; khẳng định 5 khuẩn lạc, 4 khuẩn lạc dương tính coagulase. Số khuẩn lạc khẳng định = 42 × 4/5 = 33,6 → N = 33,6 / (0,1 × 10⁻¹) = 3.360 → báo cáo 3,4 × 10³ CFU/g (ví dụ rút gọn một đĩa).

3.3. Màng lọc (membrane filtration)

Hình 4. Lọc màng 0,45 µm và khuẩn lạc trên thạch sinh màu CCA theo ISO 9308-1

Nguyên lý: màng lọc lỗ 0,45 µm giữ vi khuẩn từ thể tích mẫu lớn. Đặt màng lên môi trường, chất dinh dưỡng khuếch tán qua màng và mỗi tế bào mọc thành một khuẩn lạc. Dùng khi: mẫu lỏng, trong, mật độ thấp như nước uống, nước đóng chai, nước khoáng, nước dược, dung dịch tiêm. Mẫu đục, nhiều cặn hoặc nhiều vi sinh nền (nước thải, nước mặt) dễ tắc màng: lọc thể tích nhỏ hơn hoặc chuyển sang MPN.

• Đặt màng vô trùng (mặt kẻ ô lên trên) lên giá lọc; lọc thể tích quy định (100 mL nước uống, 250 mL nước đóng chai); tráng phễu bằng dịch pha loãng vô trùng.

• Chuyển màng lên thạch, đặt cuộn từ một mép để không có bọt khí dưới màng.

• Ủ theo phương pháp (CCA ở 36 ± 2 °C trong 21–24 giờ); đếm, khẳng định khi phương pháp yêu cầu, báo cáo CFU/100 mL hoặc CFU/250 mL. Theo SMEWW 9222, nên chọn thể tích lọc sao cho màng có khoảng 20–80 khuẩn lạc mục tiêu.

Tiêu chuẩn: ISO 9308-1 (E. coli, coliform), ISO 7899-2 (Enterococci), ISO 16266 (P. aeruginosa), ISO 14189 (C. perfringens trong nước), SMEWW 9222; chất lượng màng lọc theo ISO 7704.

Lỗi hay gặp: bọt khí dưới màng làm vùng đó không mọc; phễu nhiễm chéo giữa các mẫu; màng kém chất lượng ức chế vi sinh hoặc lỗ không đều; lọc mẫu đục cho kết quả thấp giả.

 

Ví dụ thực tế Nước giếng, lọc 100 mL, CCA ủ 36 °C trong 24 giờ: 23 khuẩn lạc hồng – đỏ (5 khuẩn lạc thử oxidase đều âm tính) và 7 khuẩn lạc xanh đậm – tím. Coliform = 23 + 7 = 30 CFU/100 mL; E. coli = 7 CFU/100 mL → không đạt QCVN 01-1:2024/BYT (coliform tổng số và E. coli đều phải < 1 CFU/100 mL).