CÁC KỸ THUẬT KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT: NGUYÊN LÝ, CÁCH LÀM VÀ CÁCH CHỌN ĐÚNG

 

7. Khẳng định và định danh

Khuẩn lạc điển hình trên thạch chọn lọc mới là kết quả giả định. Khẳng định trả lời câu hỏi “có đúng vi sinh vật mục tiêu không”, còn định danh trả lời “là loài gì”. Mọi phép thử đều cần khuẩn lạc thuần, nên cấy thuần trên thạch không chọn lọc luôn là bước đầu tiên.

Hình 8. Từ khuẩn lạc giả định đến kết quả khẳng định, định danh: các kỹ thuật và thời gian

 

Kỹ thuật	Nguyên lý	Khi nào dùng
Gram, oxidase, catalase, coagulase	Cấu trúc thành tế bào và enzym đặc trưng	Định hướng nhóm; phép thử khẳng định nhanh trong tiêu chuẩn
Sinh hoá, kit API	“Dấu vân tay” chuyển hoá đường, acid amin, enzym	Khẳng định theo tiêu chuẩn; định danh khi cần tên loài
Định danh tự động (VITEK 2…)	Thẻ sinh hoá đọc tự động	Nhiều khuẩn lạc cần định danh, kèm kháng sinh đồ
MALDI-TOF MS	Phổ khối protein (chủ yếu protein ribosome) so với thư viện	Phòng thí nghiệm nhiều mẫu; giám sát môi trường dược
Huyết thanh	Kháng thể ngưng kết kháng nguyên O, H, Vi	Bắt buộc với Salmonella; xác định nhóm, serovar
Giải trình tự toàn bộ hệ gen (WGS)	Đọc toàn bộ hệ gen	Định type, truy vết ổ dịch, gen độc lực, gen kháng thuốc (ISO 23418)

 

Lỗi hay gặp: khuẩn lạc không thuần dẫn đến định danh sai; khuẩn lạc quá già khi nhuộm Gram, thử oxidase; thử oxidase trên khuẩn lạc lấy từ thạch có chất chỉ thị màu (dương tính giả). Thẩm định: phương pháp khẳng định, định type thay thế theo ISO 16140-6; phương pháp định danh theo ISO 16140-7:2024.

8. Phương pháp nhanh: miễn dịch, sinh học phân tử, ATP

Phương pháp nhanh dùng để sàng lọc và ra quyết định sản xuất. Phần lớn vẫn cần tăng sinh. Kết quả âm tính trả được sớm; kết quả dương tính phải khẳng định bằng nuôi cấy khi cần giá trị pháp lý. Phòng thí nghiệm công nhận chỉ dùng phương pháp đã được thẩm định theo ISO 16140-2 (hoặc AOAC) và xác nhận tại phòng thí nghiệm theo ISO 16140-3.

Hình 9. Que thử miễn dịch, đường khuếch đại real-time PCR với chứng nội IAC, và máy đo ATP

8.1. Miễn dịch (ELISA, ELFA, que thử nhanh, tách miễn dịch từ)

Nguyên lý: kháng thể đặc hiệu bắt kháng nguyên của vi khuẩn hoặc độc tố; tín hiệu được đọc bằng enzym – cơ chất (ELISA), huỳnh quang (ELFA), vạch màu (que thử) hoặc ngưng kết hạt latex. Tách miễn dịch từ (IMS) dùng hạt từ phủ kháng thể để cô đặc vi khuẩn mục tiêu. Dùng khi: cần kết quả âm tính sớm (Salmonella, Listeria, E. coli O157) hoặc cần phát hiện độc tố mà nuôi cấy không làm được, ví dụ độc tố ruột tụ cầu (ISO 19020). Lưu ý: ngưỡng phát hiện khoảng 10⁵–10⁶ CFU/mL nên phải tăng sinh đủ thời gian; có thể có phản ứng chéo.

8.2. Sinh học phân tử (PCR, real-time PCR, LAMP)

Nguyên lý: khuếch đại đoạn gen đặc hiệu của vi sinh vật mục tiêu. Real-time PCR theo dõi tín hiệu huỳnh quang qua từng chu kỳ; chu kỳ tín hiệu vượt ngưỡng gọi là Ct, Ct càng nhỏ thì lượng DNA ban đầu càng nhiều. Chứng nội (IAC) chạy cùng mỗi mẫu để phát hiện ức chế. LAMP khuếch đại ở một nhiệt độ nên thiết bị gọn hơn. Dùng khi: nhiều mẫu cần sàng lọc nhanh (âm tính trong khoảng 24–30 giờ kể cả tăng sinh) hoặc mầm bệnh khó nuôi cấy (STEC, norovirus, virus viêm gan A).

• Có Ct mục tiêu và IAC đạt: dương tính giả định, khẳng định bằng nuôi cấy từ dịch tăng sinh đã lưu.

• Không có Ct mục tiêu và IAC đạt: âm tính.

• Cả mục tiêu và IAC đều không lên: mẫu bị ức chế, pha loãng DNA và chạy lại.

Tiêu chuẩn: ISO 22174 (yêu cầu chung cho PCR), ISO/TS 13136 (STEC), ISO 15216-1 (norovirus, virus viêm gan A); kit thương mại được chứng nhận theo ISO 16140-2. Lưu ý: PCR phát hiện cả DNA của tế bào chết; cần phân khu chuẩn bị hỗn hợp phản ứng, tách DNA và khuếch đại để chống nhiễm chéo.

8.3. ATP phát quang sinh học

Nguyên lý: ATP có trong mọi tế bào và trong cặn hữu cơ. Enzym luciferase cùng luciferin phản ứng với ATP phát ra ánh sáng, máy đo cường độ sáng theo đơn vị RLU. Dùng khi: thẩm tra vệ sinh bề mặt, sau CIP, trước khi chạy dây chuyền trong chương trình HACCP, ISO 22000, BRCGS, FSSC 22000; kết quả có trong khoảng 15 giây. Lưu ý: ATP không phân biệt vi sinh vật với cặn thực phẩm và không thay xét nghiệm vi sinh (Listeria, Enterobacteriaceae); ngưỡng đạt phải tự xác lập cho từng bề mặt; RLU của các hãng không quy đổi được cho nhau.

 

Ví dụ thực tế Ngưỡng ví dụ của một nhà máy chế biến thịt: đạt ≤ 150 RLU; cảnh báo 151–300 RLU; không đạt > 300 RLU. Băng tải đo được 420 RLU → vệ sinh lại, đo lại được 110 RLU → cho phép sản xuất, ghi hồ sơ hành động khắc phục.

 

8.4. Các kỹ thuật nhanh khác

Lưu lượng tế bào (flow cytometry) đếm tổng vi khuẩn trong sữa tươi trong vài phút. Hệ thống MPN tự động và hệ thống phát hiện quang học rút ngắn thời gian đếm chỉ tiêu chỉ thị trong thực phẩm. Trong dược phẩm, các phương pháp vi sinh nhanh (ATP, lưu lượng tế bào, đếm pha rắn) phải được thẩm định theo USP <1223> hoặc EP 5.1.6 trước khi thay phương pháp dược điển.

9. Kỹ thuật cho dược phẩm và phòng sạch

Nhóm kỹ thuật này bắt buộc theo GMP và dược điển (USP, EP, JP, Dược điển Việt Nam). Mọi phép thử đều phải chứng minh phù hợp với từng sản phẩm (method suitability) trước khi áp dụng thường quy.

Hình 10. Giám sát vi sinh môi trường (trái) và thử vô trùng bằng lọc màng hệ kín (phải)

 

9.1. Thử giới hạn vi sinh vật (sản phẩm không vô trùng)

Đếm tổng vi sinh vật hiếu khí (TAMC) trên thạch casein đậu tương (SCDA) ở 30–35 °C trong 3–5 ngày và tổng nấm men – nấm mốc (TYMC) trên thạch Sabouraud dextrose (SDA) ở 20–25 °C trong 5–7 ngày, bằng đổ đĩa, cấy bề mặt, màng lọc hoặc MPN (USP <61>, EP 2.6.12). Tìm vi sinh vật chỉ định như E. coli, Salmonella, P. aeruginosa, S. aureus, Candida albicans (USP <62>, EP 2.6.13). Phép thử phù hợp phương pháp dùng mức cấy không quá 100 CFU; số đếm thu hồi không được lệch quá 2 lần so với đối chứng.

9.2. Thử vô trùng

Nguyên lý: lọc mẫu qua màng có lỗ không lớn hơn 0,45 µm (hoặc cấy trực tiếp khi sản phẩm không lọc được), ủ ít nhất 14 ngày trong hai môi trường: thioglycolat lỏng (FTM) ở 30–35 °C cho vi khuẩn kỵ khí và hiếu khí, casein đậu tương (SCDM) ở 20–25 °C cho nấm và vi khuẩn hiếu khí. Không có vi sinh mọc thì sản phẩm đạt vô trùng.

Cách làm chính: thẩm định phù hợp phương pháp với không quá 100 CFU mỗi chủng S. aureus, B. subtilis, P. aeruginosa, C. sporogenes, C. albicans, A. brasiliensis; thao tác trong isolator hoặc vùng cấp A; dùng hệ lọc kín và rửa màng để loại chất kháng khuẩn của sản phẩm. Tiêu chuẩn: USP <71>, EP 2.6.1, JP 4.06. Lưu ý: độ nhạy thống kê thấp nên không thay được việc kiểm soát quy trình vô trùng; kết quả chỉ được làm lại khi chứng minh được lỗi thuộc về phép thử.

9.3. Thử nội độc tố vi khuẩn (LAL)

Thuốc thử LAL chiết từ tế bào máu con sam phản ứng với nội độc tố của vi khuẩn Gram âm; kết quả đọc bằng tạo gel (gel-clot), đo độ đục động học hoặc đo màu động học. Ngoài ra có thuốc thử yếu tố C tái tổ hợp. Áp dụng cho thuốc tiêm, nước cất pha tiêm, thiết bị y tế theo USP <85>, EP 2.6.14 và EP 2.6.32.

9.4. Giám sát vi sinh môi trường

Dụng cụ gồm đĩa lắng 90 mm (mở tối đa 4 giờ), đĩa tiếp xúc 55 mm cho bề mặt và găng tay, máy lấy mẫu khí chủ động (kết quả CFU/m³) và que swab cho vị trí khó tiếp cận. Môi trường thường là TSA bổ sung lecithin và polysorbate 80 để trung hoà chất khử trùng còn sót. Ủ theo thông lệ ở 20–25 °C rồi 30–35 °C để phát hiện cả nấm và vi khuẩn; khi vượt giới hạn, định danh vi sinh và điều tra nguyên nhân.

 

Cấp sạch	Lấy mẫu khí (CFU/m³)	Đĩa lắng (CFU/4 giờ)	Đĩa tiếp xúc (CFU/đĩa)	Dấu găng tay (CFU/găng)
A	Không mọc	Không mọc	Không mọc	Không mọc
B	10	5	5	5
C	100	50	25	–
D	200	100	50	–

 

Bảng trên là giới hạn hành động theo EU GMP Annex 1 (2022). Nhà máy thực phẩm áp dụng nguyên tắc tương tự trong chương trình giám sát Listeria, Enterobacteriaceae theo yêu cầu chứng nhận như BRCGS, FSSC 22000.

10. So sánh tổng hợp các kỹ thuật

Kỹ thuật	Loại kết quả	Thời gian	Khả năng phát hiện, khoảng đo	Giá trị pháp lý
Đổ đĩa	Định lượng	1–3 ngày	Từ khoảng 10 CFU/g (1 mL dịch 10⁻¹)	Phương pháp chuẩn
Cấy bề mặt	Định lượng	1–5 ngày	Từ khoảng 100 CFU/g (0,1 mL dịch 10⁻¹)	Phương pháp chuẩn
Cấy xoắn ốc	Định lượng	1–3 ngày	Khoảng 500–500.000/mL trên một đĩa	AOAC 977.27; cần kiểm tra xác nhận
Màng lọc	Định lượng	1–2 ngày	1 CFU/100–250 mL	Phương pháp chuẩn
MPN nhiều ống	Ước lượng định lượng	2–4 ngày	Mật độ thấp; khoảng tin cậy rộng	Phương pháp chuẩn
MPN cơ chất xác định	Định lượng	18–22 giờ	1–2.419 MPN/100 mL	ISO 9308-2, SMEWW 9223
Tăng sinh – phân lập – khẳng định	Định tính	3–5 ngày	Về lý thuyết 1 tế bào/25 g	Phương pháp chuẩn
Môi trường sinh màu	Định lượng, định tính	1–2 ngày	Như kỹ thuật cấy tương ứng	Chuẩn khi tiêu chuẩn quy định
Film khô	Định lượng	1–3 ngày	Khoảng đếm hẹp (ví dụ 15–150)	Phương pháp thay thế có chứng nhận
Khẳng định, định danh	Xác nhận loài	Vài phút – 2 ngày	Cần khuẩn lạc thuần	Bắt buộc trong phương pháp chuẩn
Miễn dịch	Định tính, sàng lọc	1–2 ngày	Cần 10⁵–10⁶ CFU/mL sau tăng sinh	Phương pháp thay thế có chứng nhận
PCR, LAMP	Định tính, sàng lọc	Khoảng 24–30 giờ	Rất nhạy sau tăng sinh	Thay thế có chứng nhận; chuẩn cho STEC, virus
ATP	Chỉ số vệ sinh (RLU)	Khoảng 15 giây	Không đếm vi sinh vật	Công cụ HACCP
Giới hạn vi sinh (dược)	Định lượng, định tính	3–7 ngày	Theo giới hạn của chuyên luận	Dược điển
Thử vô trùng	Đạt / không đạt	Ít nhất 14 ngày	Độ nhạy thống kê thấp	Dược điển
Nội độc tố	Định lượng (EU/mL)	Khoảng 1 giờ	Theo độ nhạy thuốc thử	Dược điển
Giám sát môi trường	Định lượng	5–7 ngày	CFU/m³, CFU/đĩa	Bắt buộc theo GMP

Hình 11. Thời gian ra kết quả của các kỹ thuật (ước tính, thang logarit)

 

11. Bốn nguyên tắc chọn kỹ thuật

Phòng thí nghiệm công nhận ISO/IEC 17025 (VILAS) bám phương pháp đã đăng ký, đúng số hiệu và năm ban hành. Phương pháp thay thế chỉ dùng khi có chứng nhận thẩm định (ISO 16140-2, AOAC, AFNOR, MicroVal, NordVal), đã xác nhận tại phòng thí nghiệm (ISO 16140-3) và được tổ chức công nhận chấp nhận.

Phòng QC nhà máy ưu tiên tốc độ và ít thao tác: film khô, môi trường sinh màu, ATP, PCR sàng lọc. Kết quả bất thường nên gửi phòng thí nghiệm công nhận kiểm tra lại.

Mẫu nước trong và sạch dùng màng lọc; mẫu đục, bẩn hoặc số lượng mẫu lớn dùng MPN cơ chất xác định.

Mầm bệnh sống như Salmonella, Listeria bắt buộc thao tác trong tủ an toàn sinh học cấp II, không dùng tủ cấy laminar vì tủ này không bảo vệ người làm.

Câu hỏi thường gặp

Đổ đĩa hay cấy bề mặt cho kết quả chính xác hơn? Không có kỹ thuật “chính xác hơn” cho mọi trường hợp; mỗi tiêu chuẩn phương pháp chỉ định kỹ thuật riêng. Đổ đĩa có giới hạn đếm thấp hơn 10 lần (cấy 1 mL so với 0,1 mL); cấy bề mặt cho hình thái, quầng rõ và không gây sốc nhiệt. Hãy làm đúng kỹ thuật mà tiêu chuẩn chỉ định.

Vì sao MPN và đếm khuẩn lạc cho kết quả khác nhau trên cùng một mẫu? MPN là ước lượng thống kê có khoảng tin cậy rộng (ví dụ 150 MPN/g có khoảng tin cậy 95% từ 37 đến 420), và môi trường lỏng phục hồi tế bào tổn thương tốt hơn. Hai kỹ thuật không quy đổi trực tiếp cho nhau; kết quả được so với giới hạn của chính phương pháp đã quy định.

Kết quả PCR dương tính có được báo cáo ngay không? Với phòng thí nghiệm công nhận thì không. PCR và miễn dịch là phương pháp sàng lọc: kết quả âm tính báo được ngay, kết quả dương tính phải khẳng định bằng nuôi cấy từ dịch tăng sinh đã lưu theo hướng dẫn của phương pháp đã thẩm định.

Film khô có thay được phương pháp ISO không? Chỉ khi loại film đó có chứng nhận phương pháp thay thế (AOAC, AFNOR, MicroVal, NordVal) cho nền mẫu tương ứng, đã được phòng thí nghiệm xác nhận và nằm trong phạm vi công nhận. Với QC nội bộ, film khô là lựa chọn nhanh và tiện.

Kết quả “< 10 CFU/g” có nghĩa là mẫu sạch? Không. Kết quả này chỉ cho biết không đếm được khuẩn lạc ở độ pha loãng thấp nhất đã cấy, tức là giới hạn của kỹ thuật. Khi tiêu chí là “không phát hiện trong 25 g”, phải dùng kỹ thuật định tính có tăng sinh, không dùng kết quả đếm đĩa.

ATP có thay được xét nghiệm vi sinh bề mặt không? Không. ATP đo cặn hữu cơ và tế bào nói chung, cho biết bề mặt đã sạch hay chưa. Chương trình giám sát vẫn cần lấy mẫu vi sinh bề mặt định kỳ, ví dụ Listeria, Enterobacteriaceae.

Alpha Coach đồng hành cùng phòng thí nghiệm vi sinh

Alpha Coach (ACTS – Total Lab Solutions) cung cấp vật tư, thiết bị và hỗ trợ kỹ thuật cho các kỹ thuật kiểm nghiệm vi sinh:

• Môi trường nuôi cấy SRL và Biocomma – bột, hạt, supplement kèm CoA.

• Hệ thống lọc màng, bơm chân không, máy dập mẫu WIGGENS; micropipet Microlit; màng lọc, túi dập mẫu, que cấy, đĩa Petri và dụng cụ tiêu hao.

• Chủng chuẩn; tư vấn chọn kỹ thuật, xây dựng SOP và biểu mẫu cho phòng thí nghiệm VILAS, QC nhà máy và dược phẩm.