CÁC KỸ THUẬT KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT: NGUYÊN LÝ, CÁCH LÀM VÀ CÁCH CHỌN ĐÚNG

 

4. Kỹ thuật MPN: khi không đếm được khuẩn lạc

Hình 5. MPN nhiều ống với ống Durham (trái) và MPN cơ chất xác định trên khay Quanti-Tray/2000 (phải)

4.1. MPN nhiều ống (multiple tube)

Nguyên lý: cấy cùng một lượng mẫu vào nhiều ống môi trường lỏng ở các độ pha loãng liên tiếp. Ống nhận được ít nhất một tế bào sẽ dương tính (đục, sinh khí, đổi màu). Từ tổ hợp ống dương tính, tra bảng thống kê ra số có xác suất lớn nhất (MPN). Dùng khi: mật độ thấp, mẫu đục không lọc được, cần phục hồi tế bào tổn thương (thực phẩm đông lạnh, đã xử lý nhiệt), nước thải, nhuyễn thể.

• Cấy 3 hoặc 5 ống mỗi độ pha loãng vào canh LST có ống Durham; ủ 37 °C, đọc ở 24 giờ và 48 giờ.

• Cấy chuyển ống sinh khí sang môi trường khẳng định: BGBL (coliform); canh EC ở 44 °C và thử indole (E. coli).

• Ghi tổ hợp ống dương tính đã khẳng định và tra đúng bảng MPN ứng với lượng mẫu đã cấy.

Tiêu chuẩn: ISO 4831 (coliform), ISO 7251 (E. coli giả định), ISO 16649-3 (E. coli trong nhuyễn thể), ISO 21528-1 (Enterobacteriaceae), SMEWW 9221, FDA BAM.

Lỗi hay gặp: khoảng tin cậy rất rộng; ống Durham có sẵn bọt khí trước khi ủ (dương tính giả); tra nhầm bảng (bảng phụ thuộc lượng mẫu cấy); tốn nhiều ống và 2–4 ngày.

 

Ví dụ thực tế Rau ăn sống, coliform, 3 ống mỗi mức 0,1 g – 0,01 g – 0,001 g. Sau khẳng định: 3/3 – 2/3 – 1/3 ống dương tính, tổ hợp 3-2-1. Bảng FDA BAM: 150 MPN/g, khoảng tin cậy 95% từ 37 đến 420 MPN/g → báo cáo 1,5 × 10² MPN/g.

 

4.2. MPN cơ chất xác định (Colilert, Quanti-Tray)

Nguyên lý: thuốc thử chứa hai cơ chất. Coliform có enzym β-galactosidase cắt ONPG tạo màu vàng; E. coli có thêm β-glucuronidase cắt MUG tạo chất phát huỳnh quang dưới đèn UV 365 nm. Mẫu được chia vào khay nhiều giếng, đếm giếng dương tính rồi tra bảng MPN. Dùng khi: phòng thí nghiệm nước nhiều mẫu mỗi ngày, cần ít thao tác và không cần khẳng định; dùng được cho mẫu đục sau khi pha loãng.

• Hoà 1 gói Colilert-18 vào 100 mL mẫu, đổ vào khay Quanti-Tray/2000 (49 giếng lớn, 48 giếng nhỏ) và hàn khay.

• Ủ 35 ± 0,5 °C trong 18 giờ.

• Đếm giếng vàng (coliform) và giếng vàng phát huỳnh quang (E. coli), tra bảng MPN; khoảng đo 1–2.419 MPN/100 mL mà không cần pha loãng.

Tiêu chuẩn: ISO 9308-2, SMEWW 9223 B; US EPA chấp nhận cho nước uống. Lỗi hay gặp: đọc quá thời gian quy định (dương tính giả); mẫu có màu vàng sẵn khó đọc; chi phí mỗi mẫu cao, cần máy hàn khay và đèn UV.

 

Ví dụ thực tế Nước máy, 100 mL, Colilert-18 trên khay Quanti-Tray/2000: 3 giếng lớn màu vàng, trong đó 1 giếng phát huỳnh quang; giếng nhỏ âm tính. Tra bảng: coliform 3,1 MPN/100 mL; E. coli 1,0 MPN/100 mL → không đạt QCVN 01-1:2024/BYT.

 

5. Phát hiện định tính: tăng sinh – phân lập – khẳng định

Nguyên lý: mầm bệnh trong mẫu thường rất ít và bị tổn thương. Tiền tăng sinh không chọn lọc giúp phục hồi; tăng sinh chọn lọc ức chế vi sinh nền và nhân mầm bệnh lên; thạch chọn lọc tách khuẩn lạc nghi ngờ; phép thử sinh hoá, huyết thanh xác nhận loài. Dùng khi: tiêu chí là “không phát hiện trong 25 g” (hoặc 10 g, 1 g theo quy định), ví dụ Salmonella, Listeria monocytogenes, Cronobacter, Vibrio, Campylobacter, E. coli O157.

Hình 6. Chuỗi phát hiện Salmonella theo ISO 6579-1: kết quả âm tính có từ ngày 3, dương tính khẳng định vào ngày 4–5

• Ngày 0: 25 g mẫu + 225 mL BPW, ủ 34–38 °C trong 18 giờ.

• Ngày 1: chuyển 0,1 mL sang 10 mL RVS (41,5 °C) và 1 mL sang 10 mL MKTTn (37 °C), ủ 24 giờ.

• Ngày 2: cấy ria từ mỗi ống lên XLD và một thạch thứ hai (ví dụ thạch sinh màu), ủ 37 °C trong 24 giờ.

• Ngày 3: không có khuẩn lạc điển hình ở cả hai nhánh thì báo cáo “Không phát hiện/25 g”; có khuẩn lạc điển hình thì chọn khuẩn lạc, cấy thuần.

• Ngày 4–5: khẳng định sinh hoá (TSI, urea, LDC…) và huyết thanh (O, H, Vi).

Cấy ria phân lập (streak plate)

Cấy ria 4 vùng là cách pha loãng cơ học trên mặt thạch: mỗi vùng mới chỉ mang theo một phần vi sinh từ vùng trước, đến vùng cuối các tế bào tách rời và mọc thành khuẩn lạc riêng rẽ. Đây là bước bắt buộc trước mọi phép khẳng định, định danh. Chỉ chọn khuẩn lạc ở vùng có khuẩn lạc riêng rẽ, không chọn ở vùng ria dày.

Tiêu chuẩn: ISO 6579-1 (Salmonella), ISO 11290-1 (Listeria), ISO 22964 (Cronobacter), ISO 21872-1 (Vibrio), ISO 10272-1 (Campylobacter), ISO 16654 (E. coli O157); dược phẩm: USP <62>.

Lỗi hay gặp: ủ sai nhiệt độ (RVS phải ở 41,5 ± 1 °C); tự rút gọn số môi trường tăng sinh hoặc thạch phân lập; bỏ qua khẳng định trong khi Proteus, Citrobacter sinh H₂S cho khuẩn lạc giống Salmonella trên XLD; thao tác mầm bệnh sống ngoài tủ an toàn sinh học cấp II.

 

Ví dụ thực tế Thịt gà xay, chỉ tiêu Salmonella/25 g: XLD có khuẩn lạc đỏ tâm đen; TSI đáy vàng, mặt nghiêng đỏ, sinh H₂S; urea âm tính; LDC dương tính; ngưng kết với kháng huyết thanh đa giá O → “Phát hiện Salmonella spp. trong 25 g”. Khuẩn lạc trông tương tự nhưng urea dương tính → loại trừ Salmonella, nhiều khả năng là Proteus.

 

6. Nuôi cấy cải tiến: môi trường sinh màu và film khô

Hình 7. Màu khuẩn lạc đặc trưng trên TBX, CCA, ALOA và film khô E. coli/coliform

6.1. Môi trường sinh màu (chromogenic)

Nguyên lý: môi trường chứa cơ chất gắn chất tạo màu; chỉ vi sinh có enzym đặc hiệu mới cắt được nên khuẩn lạc mang màu riêng. Trên TBX, E. coli (β-glucuronidase) có màu xanh lam. Trên CCA, coliform có màu hồng – đỏ, E. coli xanh đậm – tím. Trên ALOA, Listeria có màu xanh lục lam, riêng L. monocytogenes có thêm quầng đục. Dùng khi: tiêu chuẩn đã quy định môi trường sinh màu (TBX, CCA, ALOA, CCI); khi đó đây chính là phương pháp chuẩn. Thạch sinh màu dùng thay môi trường truyền thống ngoài quy định của tiêu chuẩn phải được thẩm định.

Ưu điểm và lưu ý: đọc nhanh, khách quan, giảm hoặc bỏ bước khẳng định. Đổi lại, giá cao hơn môi trường thường và có thể bỏ sót chủng không điển hình: E. coli O157:H7 và một tỷ lệ nhỏ E. coli khác không có β-glucuronidase nên không cho màu xanh trên TBX. Bảo quản và ủ tránh ánh sáng, đọc đúng giờ.

 

Ví dụ thực tế Rau xà lách, E. coli trên TBX ủ 44 °C trong 24 giờ, 2 đĩa × 1 mL dịch 10⁻¹: 35 và 41 khuẩn lạc xanh lam. N = (35 + 41) / (1 × 2 × 10⁻¹) = 380 → báo cáo 3,8 × 10² CFU/g; theo ISO 16649-2 không cần khẳng định thêm.

 

6.2. Film khô (Petrifilm, Compact Dry)

Nguyên lý: môi trường dinh dưỡng, chất tạo gel tan trong nước lạnh và chất chỉ thị được phủ khô trên film. Thêm 1 mL mẫu, gel hình thành và khuẩn lạc mọc với màu, bọt khí đặc trưng. Về bản chất, đây là đổ đĩa thu nhỏ, sẵn dùng. Dùng khi: phòng QC nhà máy kiểm tra nội bộ nguyên liệu, nước, bề mặt mà không có nhân lực pha môi trường. Phòng thí nghiệm công nhận chỉ dùng khi phương pháp có chứng nhận (AOAC, AFNOR, MicroVal, NordVal) và nằm trong phạm vi công nhận.

Lưu ý: khoảng đếm hẹp (film E. coli/coliform: 15–150 khuẩn lạc trên vùng mọc khoảng 20 cm²); mẫu màu đậm, nhiều hạt như gia vị, cacao khó đọc; khó lấy khuẩn lạc để khẳng định; xếp chồng film khi ủ theo hướng dẫn của hãng.

 

Ví dụ thực tế Nước đá viên, film E. coli/coliform ủ 37 °C, 1 mL dịch 10⁻¹: 28 khuẩn lạc đỏ có bọt khí và 6 khuẩn lạc xanh có bọt khí. Coliform = (28 + 6) / 10⁻¹ = 340 CFU/mL; E. coli: 6 khuẩn lạc, dưới khoảng đếm → báo cáo ước tính 60 CFU/mL.